來源：中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會分子診斷學組.肝細胞癌生物標志物檢測及應用專家共識[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2020,41(24):2945-2948.
原發(fā)性肝癌(PLC)是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,嚴重威脅人類健康。PLC的病理類型主要包括肝細胞癌(HCC)、肝內膽管癌(ICC)和混合型肝癌(HCC-ICC),其中HCC 占85%~90%。目前已知的HCC主要病因包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、飲酒、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、黃曲霉毒素、藍藻毒素等。不同于日本、歐美地區(qū)國家HCC的致病因素,我國HBV 感染是HCC最主要的原因,約85%HCC是由HBV 感染引起。
隨著診療技術水平的提高,HCC防治工作取得長足進步,但由于HCC 起病隱匿、進展迅速,大多數(shù)病例確診時已處于中晚期，因此，HCC早期篩查和診斷成為關鍵。為了提高HCC生物標志物臨床應用的科學性、合理性和可操作性,最大限度發(fā)揮其效能,受中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會委托,由分子診斷學組牽頭，征求HCC臨床和基礎研究領域專家意見,多學科參與形成本共識。后續(xù)將根據(jù)相關領域的研究進展,適時修訂，以適應臨床應用的需求。
目前,臨床上常用于檢測和輔助診斷HCC 的血清學標志物有甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質體(AFP-L3)、異常凝血酶原(DCP)等,其中AFP 是HCC輔助診斷和療效監(jiān)測中最常用的標志物。
AFP是最早用來輔助診斷HCC的血清學指標,也是主要由胚胎肝臟、卵巢產生和分泌的一種胚胎特異性糖類蛋白,參與分子轉運過程。妊娠期婦女血清AFP水平明顯升高,但健康成人血清AFP水平極低。血清AFP≥400 ng/mL超過1個月,排除妊娠、慢性或活動性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤及其他消化道腫瘤后,高度提示HCC,聯(lián)合影像學檢查,對HCC有較好的診斷價值。AFP水平輕度升高患者,應進行動態(tài)觀察;AFP陰性患者,需借助其他血清學標志物、影像學檢查或穿刺活檢等手段明確診斷。目前檢測AFP的常用方法包括電化學發(fā)光法和化學發(fā)光法等。 根據(jù)AFP與小扁豆凝集素的結合程度,從高到低將AFP 分為3個亞型:AFP-L1、AFPL2、AFP-L3。AFP-L1主要見于良性肝臟疾病;AFPL2主要來源于卵黃囊,多見于孕婦;AFP-L3主要是由肝癌細胞產生,其與腫瘤組織的大小、分化、惡性程度密切相關,特異度高于AFP。當AFP-L3 比率(AFP-L3%)臨界值達10% 時,診斷最大徑<5 cmHCC 的靈敏度為22.0% ~33.0%,特異度為93.0%~94.0%;對于AFP 陰性(<20 ng/mL)HCC 患者,AFP-L3% 的診斷靈敏度為12.0%~21.0%,特異度為97.0%~98.0%,隨著AFP-L3檢測方法學靈敏度的提高,AFP-L3輔助診斷HCC的靈敏度和特異度可能會進一步提升。血清高水平AFP-L3%與腫瘤增殖快、侵襲性高和預后不良明顯相關。在慢性乙型肝炎患者及肝硬化高危人群中,AFP-L3%檢測與影像學檢查相比,可提前預警患者是否存在HCC。在HCC根治術后,若AFP-L3%降低不明顯,提示存在轉移灶或殘余癌,因此,AFPL3%檢測可作為HCC 復發(fā)及預后判斷指標。目前,AFP-L3的檢測方法包括親和吸附離心法、磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析法、微流控免疫熒光法等。親和吸附離心法的優(yōu)點是不需要特殊設備,可依托實驗室定量檢測AFP的設備完成檢測,缺點是需要手工操作、步驟多、耗時長,結果重復性欠佳。磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析法及微流控免疫熒光法可實現(xiàn)自動化檢測,結果更穩(wěn)定。隨著方法學的不斷進步,建議有條件的實驗室在采用不同方法學時可依據(jù)臨床自建臨界值。DCP又稱維生素K 缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導的蛋白質(PIVKA-Ⅱ),是凝血酶原的一種異常形式,其相關檢測產品在國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)的注冊名稱為PIVKAⅡ。在肝細胞癌變過程中,由于維生素K缺乏引起凝血酶原前體羧化不全,從而產生大量異常凝血酶原。在HCC患者中,血清DCP水平與HCC腫瘤大小、分化程度、微血管侵犯和腫瘤復發(fā)高度相關,可單獨作為早期篩查和預后評估的標志物。當DCP≥40 mAU/mL 時,其診斷靈敏度為74.0%,特異度為86.0%,但需要對維生素K 缺乏引起的相關疾病,以及使用藥物(抗血栓藥物華法林、頭孢菌素類抗菌藥物等)治療導致DCP水平異常升高的情況進行鑒別診斷。在鑒別肝硬化、慢性肝炎和HCC能力方面,DCP 診斷靈敏度和特異度均優(yōu)于AFP。研究發(fā)現(xiàn),DCP和AFP作為兩個獨立的生物標志物,二者對HCC 診斷具有互補作用,AFP+AFPL3%和AFP+AFP-L3%+DCP聯(lián)合檢測診斷HCC的靈敏度分別為79.0%和83.0%,特異度分別為87.0%和75.0%。目前國內DCP檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫化學發(fā)光法、微粒子化學發(fā)光法、微流控免疫熒光法。GALAD 評分系統(tǒng)主要是基于HCC常用血清學標志物AFP、AFP-L3、DCP水平等構建的數(shù)學模型,可提高早期HCC的檢出率,包括性別、年齡、AFP-L3、AFP和DCP 5個指標。評分公式為GALAD=-10.08+0.09×年齡+1.67×性別+2.34×log10(AFP)+0.04×AFP- L3+1.33×log10(DCP)。公式中男性設為1;女性設為0。當GALAD評分臨界值定為-0.63時,診斷HCC 的靈敏度為68.0%,特異度為95.0%。由于該評分系統(tǒng)基于國際隊列研究,非病毒性感染是早期HCC的主要致病因素,在我國并未得到驗證。目前國內已建立基于病毒感染相關HCC 為主的中國GALAD(C-GALAD)評分系統(tǒng),靈敏度和特異度有望進一步提高。(1)對于慢性HBV、HCV 感染等原因導致的肝硬化等HCC 高危患者,尤其AFP 陰性患者,建議AFP、AFP-L3%和DCP 聯(lián)合檢測,同時結合肝臟超聲檢查結果,以進一步提高HCC早期篩查檢出率。
(2)對于AFP水平輕度升高者,除動態(tài)監(jiān)測AFP水平變化外,建議聯(lián)合檢測AFP-L3%、DCP,結合肝臟炎癥狀況以提高HCC鑒別診斷準確率。(3)對于HCC術后患者,尤其AFP、AFP-L3%、DCP水平升高者,建議定期檢測AFP、AFP-L3%和DCP作為療效監(jiān)測、預后及復發(fā)判斷的標志物。(4)GALAD 評分系統(tǒng)有助于早期HCC 篩查和診斷,臨床價值仍需大規(guī)模隊列研究進一步驗證。(5)建議實驗室采用磁微粒化學發(fā)光免疫分析法及微流控免疫熒光法檢測AFP-L3%;酶聯(lián)免疫化學發(fā)光法和微粒子化學發(fā)光法檢測DCP,檢測系統(tǒng)應用前需進行性能評估。在對患者進行監(jiān)測和隨訪時,建議使用同種定量檢測方法進行檢測,以避免不同檢測方法學間引起的差異。GPC-3是一種可調控細胞增殖、分化、遷移和黏附的蛋白多糖,與惡性腫瘤代謝密切相關。GPC-3在正常或良性肝病組織中不表達或表達極低,而在HCC組織中呈現(xiàn)高表達,且其表達水平與HCC分化程度呈正相關,是輔助診斷HCC的一種特異性相關抗原。在慢性病毒性肝炎導致的HCC患者血清中,GPC-3診斷HCC的靈敏度為47.0%,特異度為93.5%。因此,GPC-3在鑒別肝臟良、惡性病變中有一定價值,可作為HCC組織學標志物,但其作為明確的HCC外周血鑒別診斷標志物仍需進一步證實。AFU 是一種溶酶體水解酶,主要存在于哺乳動物肝、腎等組織,參與多種生物活性物質的分解代謝。HCC 患者血清中AFU水平明顯高于健康人群和肝硬化患者,其診斷HCC的靈敏度為60.0% ~90.0%,特異度為55.0% ~98.0%,對AFP陰性病例及小細胞HCC有輔助診斷價值,且可作為HCC 術后復發(fā)和療效監(jiān)測的指標。 GGT 是一種在人體中廣泛分布的質膜結合糖蛋白,主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種同工酶。其中GGT-Ⅱ在HCC細胞中表達明顯升高,但在肝內外膽道阻塞及其他肝病中均有較高表達,假陽性較高。OPN是一種分泌型糖蛋白,在多種腫瘤中高表達,具有促進細胞趨化、黏附和遷移等作用,對AFP陰性的HCC具有輔助診斷價值。 DKK1是一種高度保守的分泌型糖蛋白,是腫瘤信號通路中重要的調節(jié)蛋白,主要通過Wnt/β-catenin信號通路調控腫瘤增殖和凋亡,在HCC中表達水平明顯上調[22]。DKK1作為HCC診斷標志物的臨床價值尚需進一步研究證實。其他如高爾基體蛋白73(GP73),為高爾基體跨膜蛋白,病毒感染時其表達上調,在正常肝組織中幾乎不表達或低表達,曾認為其與HCC發(fā)生、發(fā)展密切相關,目前認為GP73主要是診斷肝硬化的標志物,而肝硬化與HCC的鑒別是臨床的關注點,因此不建議將其作為HCC標志物。(1)建議將GPC-3、AFU 結合影像學檢查作為HCC診斷的輔助指標,AFU 可用于HCC 患者復發(fā)及療效判斷的輔助監(jiān)測指標。(2)由于GGT-Ⅱ、OPN 及DKK1作為HCC 診斷標志物尚缺乏足夠的理論和實踐支撐,目前認為僅可用作HCC診斷的參考指標。(3)上述血清學標志物不可用作單獨證據(jù)進行HCC的篩查、診斷、預后判斷及療效監(jiān)測。(4)以上血清學標志物檢測尚未建立國際公認的參考方法和(或)可實現(xiàn)量值溯源的標準物質,不同檢測系統(tǒng)的檢測結果尚不具有可比性,臨床應用時需關注不同來源檢測結果之間的差異。3.1 循環(huán)游離微小核糖核酸(miRNA)miRNA 是一類由21~25個核苷酸構成的非編碼小分子RNA,能夠通過阻斷靶基因表達調控細胞增殖、分化等多種生理病理過程,在HCC發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。多中心臨床研究結果表明,循環(huán)游離miRNA 在HCC早期階段(癌前或極低腫瘤負荷狀態(tài))即表現(xiàn)出異常,檢測循環(huán)游離miRNA 組合對于輔助HCC早期診斷具有較高價值。基于7種血漿miRNA(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801)的HCC診斷模型對早期HCC的診斷靈敏度為86.1%,明顯優(yōu)于AFP,特異度為76.8%;對AFP<400 ng/mL的HCC診斷靈敏度為77.7%,特異度為84.5%。CTC是由原發(fā)實體腫瘤脫落轉移至循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞,在腫瘤轉移過程中發(fā)揮至關重要的作用,可作為HCC預后預測和療效評價的有效指標。研究發(fā)現(xiàn),外周血CTC 數(shù)目是HCC患者術后復發(fā)的獨立危險因素,術后早期轉移HCC患者CTC檢出率達90.5%。CTC數(shù)量和陽性率伴隨TNM 分期的進展不斷增加，對HCC進展具有預測作用。ctDNA 是由腫瘤細胞凋亡或壞死而釋放到外周血的特異性突變DNA 片段,攜帶原位腫瘤基因組信息。研究結果表明,ctDNA對HCC 早期診斷具有較好的臨床應用價值,診斷靈敏度和特異度均高于血清AFP。ctDNA 甲基化、5-hmc羥甲基化等表觀遺傳修飾,也可用于HCC早期診斷和預后預測。外泌體是一種由細胞內多囊泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質的直徑為30~150 nm的膜性囊泡,通過直接融合、胞吞等方式參與細胞間信息交流,進而調控腫瘤侵襲、轉移和耐藥等過程。近年研究結果顯示,腫瘤細胞外泌體包裹的蛋白質、核酸(miRNA、lncRNA 等)、脂類等生物活性組分,能夠直接反映腫瘤的惡性生物學特性,可以作為HCC診斷、判斷復發(fā)和預后預測的生物標志物。(1)循環(huán)游離miRNA 組合可以作為HCC 的輔助診斷或篩查指標,尤其是對血清AFP陰性人群。(2)CTC、ctDNA 和外泌體等作為診斷HCC 的血清學標志物尚缺乏大規(guī)模、多中心、前瞻性臨床試驗結果,且缺乏組織和腫瘤特異性特征,建議可作為HCC患者診斷、治療監(jiān)測和預后預測的參考指標。(3)以上血清學標志物檢測成本較高,影響因素尚不明確,缺乏國際公認的參考方法,臨床應用時需關注不同檢測系統(tǒng)導致的結果差異。HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個錯綜復雜的過程,實現(xiàn)HCC的早診斷、早治療、有效防治和精準診療意義重大。HCC相關標志物眾多,但至今無法實現(xiàn)通過某一標志物準確診斷。以AFP為代表的HCC 標志物簡便易行,尤其適用HBV 感染相關的HCC,但在靈敏度和特異度方面仍有不足,易造成誤診和漏診。因此,科學地開展多種標志物聯(lián)合檢測,同時推進標志物檢測方法標準化是提高現(xiàn)有HCC標志物臨床應用效能的有效途徑。目前臨床上常使用AFP、AFP-L3和DCP聯(lián)合檢測,大大提高了診斷效能,改善了患者生存質量,延長了患者總生存期。近年來,液體活檢成為研究熱點,在HCC早期診斷和療效評價方面發(fā)揮了重要作用,但仍需進一步開展大樣本前瞻性研究和回顧性研究。
執(zhí)筆者:陳茜(山東大學第二醫(yī)院);王巖(山東大學第二醫(yī)院);杜魯濤(山東大學第二醫(yī)院);公衍文(山東大學第二醫(yī)院);王立水(山東大學齊魯醫(yī)院);牛愛軍(山東大學第二醫(yī)院)。
共識制訂專家組成員(按姓氏漢語拼音排序):曹永彤(中日友好醫(yī)院);陳磊(中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院);陳葳(西安交通大學第一附屬醫(yī)院);崔巍(中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院);段勇(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院);府偉靈(中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院);高春芳(中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院);關明(復旦大學附屬華山醫(yī)院);關秀茹(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院);胡成進(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院);李莉(上海市第一人民醫(yī)院);李玉亮(山東大學第二醫(yī)院);劉家云(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學附屬西
京醫(yī)院);羅陽(重慶大學醫(yī)學院);毛海婷(山東大學第二醫(yī)院);潘世揚(江蘇省人民醫(yī)院);秦雪(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院);汪俊軍(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院);王成彬(中國人民解放軍總醫(yī)院);王傳新(山東大學第二醫(yī)院);王紅陽(中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院);王磊(山東大學第二醫(yī)院);王利新(寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院);徐建(江蘇省人民醫(yī)院);袁宏(大連醫(yī)科大學附屬大連市中心醫(yī)院);張義(山東大學齊魯醫(yī)院);鄭磊(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院)。
通信作者,王傳新,E-mail:wcx6601@126.com。
共同通信作者,王紅陽,E-mail:hywangk@vip.sina.com。
來源：國際檢驗醫(yī)學雜志、CACLP體外診斷資訊
